自研体外细胞转染试剂CRTrans上新

细胞转染试剂说明书

本细胞转染试剂作为新一代的转染试剂，其转染原理是带正电的阳离子聚合物与核酸中带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过胞吞作用进入细胞。

本产品具有转染效率高，细胞毒性低，操作简单，重复性好，适用范围广等特点。

冰袋运输，4°C保存，保质期12个月。

不可冷冻！

1、接种细胞

贴壁细胞：根据细胞的增殖速度，确定接种密度。如果不需要药杀，尽量确保转染16-24小时后，细胞汇合度低于95%。如果需要药杀，细胞增殖较慢的情况下，尽量确保转染16-24小时后，细胞汇合度在75%以下；细胞增殖较快的情况下，尽量确保转染16-24小时后，细胞汇合度低于95%，在传代后再进行药杀。

贴壁细胞：根据细胞的增殖速度，确定接种密度。如果不需要药杀，尽量确保转染16-24小时后，细胞汇合度低于95%。如果需要药杀，细胞增殖较慢的情况下，尽量确保转染16-24小时后，细胞汇合度在75%以下；细胞增殖较快的情况下，尽量确保转染16-24小时后，细胞汇合度低于95%，在传代后再进行药杀。

2、准备

以下“适量”均参考表格来定。

第二天，取合适大小的2份离心管，离心管规格根据稀释液的体积来定。

向离心管中加入适量的DMEM培养基或OPTI-MEM I培养基到上一步中的离心管中，备用。该处培养基加入培养基原液，不能包含药物成分。

3、配制转染复合物

向其中一支离心管中加入适量的质粒，吹打混匀，在管上做好标记（质粒稀释管）。该稀释液可以放置较长时间，但需要控制在1小时内。

再向另一支离心管中加入适量的转染试剂，立即轻轻吹打混匀，然后立即加入到对应的质粒稀释管中，并立即轻轻吹打均匀。该步骤加入转染试剂和转移到质粒稀释管必须连续操作。

关闭离心管盖，室温静置孵育10-15 分钟。

4、转染

在孵育时间到之前，弃去细胞培养器皿中的原培养液，加入适量的培养基。该培养基可以加入血清等必要成分，但不要包含任何药物成分，比如：嘌呤霉素、双抗、新霉素等。

将转染复合物，轻轻的均匀滴加到细胞培养液表面，不要直接全部加到同一区域，放置细胞过量粘附转染复合物。

之后再通过培养器皿的摆动，将转染复合物与培养基混合均匀。该过程注意轻缓，防止细胞脱落。

5、培养过夜

在细胞对应的培养条件，静置培养过夜。

6、去除转染试剂

转染16-24小时，将原培养基弃掉，加入新鲜的完全培养基。

或根据需要进行其它操作。

7、“适量”表述

不同培养器皿，对应的稀释液用量、DNA用量、转染试剂用量、培养液的用量，见下表。

【注】：该表使用量仅供参考，具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。

以 24 孔板，293T细胞，pEGFP-C1质粒为例。

1、准备细胞

接种1×105细胞于24孔板。

2、准备

第二天，取2个1.5 mL离心管，向离心管中分别加入40uL的DMEM培养基。

3、配制转染复合物

计算1ug目的质粒对应的质粒溶液的体积。

向其中一支离心管中加入1ug的质粒，吹打混匀，在管上做好标记。

再向另一支离心管中加入3uL的转染试剂，立即轻轻吹打约5次，然后立即加入到质粒稀释管中，并立即轻轻吹打约10次。

关闭离心管盖，室温静置孵育10 分钟。

4、转染

孵育时间结束时，取出细胞培养器皿。吸除细胞培养器皿中的原培养液，加入0.5 mL的不含药物的完全培养基（10% FBS，90% DMEM）。操作结束时，转染复合物孵育时长应在15分钟内。

将80 uL转染复合物，轻轻的均匀滴加到细胞培养液表面各个区域。

轻轻摆动培养器皿，将转染复合物与培养基混合均匀。

5、培养过夜

37°C，5%的CO2的条件下，静置培养过夜。

6、去除转染试剂

转染16小时，将原培养基弃掉，加入新鲜的完全培养基。

1、质粒质量

务必使用高纯度无内毒素转染级质粒。通过OD260测定DNA浓度，浓度扩增在1ug/uL以上，OD260/OD280比值控制在1.8-2.0的范围之内）。并通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性，以保证转染的有效性。

2、细胞条件

使用适当保存和经常传代的健康细胞。确保细胞没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。

3、细胞培养液

本转染试剂可用于有血清培养基的转染，但不要包含任何药物成分，比如：嘌呤霉素、双抗、新霉素等。

4、稀释液

血清对转染复合物的形成有较大的影响，因此稀释液中不能添加血清。同时也不能添加任何药物成分。

5、混合

转染试剂稀释并混匀后，需要立即转移到质粒稀释液中。

并且一定是转染试剂稀释液加入到质粒稀释液中。

孵育在室温静置的最佳时间为10-15 分钟。

6、DNA与转染试剂配比优化

不同的细胞类型对应不同的最佳DNA和转染试剂配比，初次使用应优化该配比DNA，以得到最大的转染效率。一般范围控制在： 1 μg的DNA使用1 - 5 μL的本转染试剂进行优化，通常1 μg的DNA使用2- 4 μL的本转染试剂。

7、转染复合物用量

不同细胞对转染试剂的耐受性不同，在细胞转染状态良好的情况下，同时为了进一步提高转染效率，可以适当增加转染复合物的用量。比如：24孔的转染复合物的使用量是80 uL，此处可以增加到100 uL、120uL等。