CRISPR/Cas9文库筛选

选择待研究的基因类群，根据每个基因设计4-6个最优的sgRNA，合成并构建sgRNA文库。通过包装慢病毒，将不同的sgRNA的Cas9病毒侵染到宿主细胞中。确保每个细胞仅被一个病毒侵染，以便使每个细胞仅会产生一种基因发生改变。

通过不同的处理，比如目标药物的作用，最终使某些基因敲除对应的细胞再细胞总群中的比例发生改变，进而通过高通量测序获得丰度发生改变的基因名称。

1、设计sgRNA文库

文库的大小是影响筛选结果的关键因素之一。全基因组文库包含超过10万个sgRNA，一方面可以识别更多感兴趣的基因，但另一方面也会耗费大量时间和金钱。

2、合成并构建慢病毒载体

CRISPR/Cas9高通量文库筛选方法中，最关键的步骤是构建慢病毒载体。确保每种sgRNA在文库载体中丰度相同，但一般只能保证丰度相近；同时确保sgRNA种类数量不发生改变。

3、慢病毒包装及侵染宿主细胞

将sgRNA文库穿梭载体进行慢病毒包装，并以较低的MOI值侵染目的细胞系，确保每个细胞只进入1个病毒，从而实现不同的sgRNA相对应基因的功能筛选。

4、阳性或阴性筛选

通过文库进行基因研究的差异或独特性就在筛选条件的设计上。一般有药物的阳性或阴性筛选；也有基因调控方向的筛选，会涉及到前期的细胞系改造。

5、高通量测序与生信分析

提取基因组DNA，并对sgRNA的靶向区域进行PCR扩增，通过高通量测序以量化不同sgRNA的相对丰度。根据筛选前后的sgRNA相对丰度变化确定sgRNA是被富集还是丢失，这些丰度变化比较大的即为候选基因。利用生物信息学方法排除掉候选基因中假阳性或假阴性的筛选结果。比如：利用生物信息学工具可通过评估同一基因中多个sgRNA的富集水平，来确定该基因是否是具有较高的研究价值。

6、验证候选基因

用CRISPR/Cas9技术筛选出若干个候选基因后，进一步验证非常必要。进行单个基因敲除，并获得该基因敲除细胞系，在基因组测序和转录水平测序确认该基因已被敲除。在此敲除细胞系的基础上，重复筛选条件的实验，检测实验的可重复性。此后，再进行更进一步相关研究。