文库慢病毒

CRISPR/Cas9系统是一种原核生物的免疫系统，是细菌用来抵抗病毒和外源质粒入侵的一种防御机制。目前最成熟且应用最广的是Type II的CRISPR/Cas9系统，其原理是利用gRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶结合到DNA的靶序区域。当Cas9核酸内切酶为野生型的，其会在该靶序区域的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂，随之利用细胞的非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）的方式对切割位点进行修复，实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。当Cas9核酸内切酶为突变型的，其无法在该靶序区域的PAM上游进行切割，只会结合在该区域，起到定位与之偶联蛋白的作用，再通过这些偶联蛋白发挥功能，实现干扰或过表达目的基因的效果。

慢病毒（Lentivirus）包装所用载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷1型病毒）为基础，使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体。由于其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，且不具有自我增殖的能力，属于假型病毒。慢病毒具有感染谱广泛特点，并且可以有效感染分裂和非分裂细胞。侵染宿主细胞后，慢病毒利用反转录酶将其RNA转录成双链DNA，随后永久的整合到宿主细胞的染色体中，实现长时间稳定表达。 此外，慢病毒免疫原性低，不易造成免疫反应，所以现在慢病毒系统除了被广泛应用到各种细胞系、活体动物实验中。

利用慢病毒载体大规模导入全基因组sgRNA文库，能够同时靶向数千个基因，实现高通量的功能基因筛选。